Миодистрофия Дюшенна — одно из нечасто встречающихся, но все же относительно распространенных генетических заболеваний. Болезнь диагностируется в трех-пятилетнем возрасте, обычно у мальчиков, проявляясь поначалу лишь в затрудненных движениях, к десяти годам страдающий такой миодистрофией уже не может ходить, к 20−22 годам его жизнь заканчивается. Она вызвана мутацией гена дистрофина, который находится в Х-хромосоме. Он кодирует белок, соединяющий мембрану мышечной клетки с сократительными волокнами. Функционально это своеобразная пружина, обеспечивающая плавное сокращение и целостность клеточной мембраны. Мутации в гене приводят к дистрофии скелетных мышечных тканей, диафрагмы и сердца. Лечение заболевания носит паллиативный характер и позволяет лишь немного облегчить страдания. Однако с развитием генной инженерии появился свет в конце тоннеля.
О войне и мире
Генная терапия — это доставка внутрь клетки конструкций на основе нуклеиновых кислот для лечения генетических заболеваний. С помощью такой терапии можно исправить генетическую проблему на уровне ДНК и РНК, меняя процесс экспрессии нужного белка. Например, в клетку можно доставить ДНК с исправленной последовательностью, с которой синтезируется функциональный белок. Или, напротив, возможны удаления определенных генетических последовательностей, что также поможет уменьшить вредные последствия мутации. В теории это просто, однако на практике генная терапия базируется на сложнейших технологиях работы с объектами микромира и представляет собой совокупность передовых ноу-хау в области молекулярной биологии.
Инъекция ДНК в пронуклеус зиготы — одна из самых ранних и наиболее традиционных технологий создания трансгенов. Инъекция производится вручную с помощью сверхтонких игл под микроскопом с 400-кратным увеличением.
«Ген дистрофина, мутации которого порождают миодистрофию Дюшенна, огромный, — рассказывает директор по развитию биотехнологической компании «Марлин Биотех», кандидат биологических наук Вадим Жерновков. — Он включает в себя 2,5 млн пар нуклеотидов, что можно было бы сравнить с количеством букв в романе «Война и мир». И вот представим себе, что мы вырвали из эпопеи несколько каких-то важных страниц. Если на этих страницах описываются существенные события, то понимание книги было бы уже затруднено. Но с геном все сложнее. Найти другую копию «Войны и мира» несложно, и тогда недостающие страницы можно было бы прочитать. Но ген дистрофина находится в X-хромосоме, а у мужчин она одна. Таким образом, в половых хромосомах у мальчиков при рождении хранится лишь одна копия гена. Другую взять негде.
Наконец, при синтезе белка из РНК важно сохранение рамки считывания. Рамка считывания определяет, какая группа из трех нуклеотидов считывается как кодон, что соответствует одной аминокислоте в белке. Если произошло удаление в гене фрагмента ДНК, не кратное трем нуклеотидам, происходит сдвиг рамки считывания — кодировка изменяется. Это можно было бы сравнить с ситуацией, когда после вырванных страниц во всей оставшейся книге все буквы заменятся на следующие по алфавиту. Получится абракадабра. Вот то же самое происходит с неправильно синтезируемым белком».
Биомолекулярный пластырь
Один из эффективных методов генной терапии для восстановления нормального синтеза белка — пропуск экзонов с помощью коротких нуклеотидных последовательностей. В «Марлин Биотех» уже отработана технология работы с геном дистрофина с помощью такого метода. Как известно, в процессе транскрипции (синтеза РНК) сначала формируется так называемая прематричная РНК, заключающая в себе как кодирующие белок участки (экзоны), так и некодирующие (интроны). Далее начинается процесс сплайсинга, в ходе которого интроны и экзоны разъединяются и формируется «зрелая» РНК, состоящая только из экзонов. В этот момент некоторые экзоны можно заблокировать, «залепить» с помощью особых молекул. В итоге в зрелой РНК не окажется тех кодирующих участков, от которых мы предпочли бы избавиться, и таким образом восстановится рамка считывания, белок будет синтезироваться.
«Эту технологию мы отладили in vitro, — рассказывает Вадим Жерновков, то есть на клеточных культурах, выращенных из клеток пациентов с миодистрофией Дюшенна. Но отдельные клетки — это не организм. Вторгаясь в процессы клетки, мы должны наблюдать последствия вживую, однако привлечь к испытаниям людей не представляется возможным по разным причинам — от этических до организационных. Поэтому возникла необходимость получения модели миодистрофии Дюшенна с определенными мутациями на основе лабораторного животного».
Как уколоть микромир
Трансгенные животные — это полученные в лаборатории животные, в геном которых целенаправленно, осознанно внесены изменения. Еще в 70-е годы прошлого века стало понятно, что создание трансгенов — это важнейший метод исследования функций генов и белков. Одним из самых ранних методов получения полностью генно-модифицированного организма стала инъекция ДНК в пронуклеус («предшественник ядра») зигот оплодотворенных яйцеклеток. Это логично, так как модифицировать геном животного проще всего в самом начале его развития.
На схеме продемонстрирован процесс CRISPR/Cas9, в котором участвуют субгеномная РНК (sgRNA), ее участок, работающий как РНК-гид, а также белок-нуклеаза Cas9, который рассекает обе нити геномной ДНК в указанном РНК-гидом месте.
Инъекция в ядро зиготы — весьма нетривиальная процедура, ведь речь идет о микромасштабах. Яйцеклетка мыши имеет диаметр 100 мкм, а пронуклеус — 20 мкм. Операция происходит под микроскопом с 400-кратным увеличением, однако инъекция — это самая что ни на есть ручная работа. Разумеется, для «укола» применяется не традиционный шприц, а специальная стеклянная игла с полым каналом внутри, куда набирается генный материал. Один ее конец можно держать в руке, а другой — сверхтонкий и острый — практически не виден невооруженным глазом. Конечно, такая хрупкая конструкция из боросиликатного стекла не может храниться долго, поэтому в распоряжении лаборатории есть набор заготовок, которые непосредственно перед работой вытягиваются на специальном станке. Используется особая система контрастной визуализации клетки без окрашивания — вмешательство в пронуклеус само по себе травматично и является фактором риска для выживания клетки. Краска стала бы еще одним таким фактором. К счастью, яйцеклетки достаточно живучи, однако количество зигот, которые дают начало трансгенным животным, составляют лишь несколько процентов от общего числа яйцеклеток, в которые была сделана инъекция ДНК.
Следующий этап — хирургический. Проводится операция по трансплантации микроинъецированных зигот в воронку яйцевода мыши-реципиента, которая станет суррогатной матерью будущим трансгенам. Далее лабораторное животное естественным путем проходит цикл беременности, и на свет появляется потомство. Обычно в помете находится около 20% трансгенных мышат, что также говорит о несовершенстве метода, ибо в нем присутствует большой элемент случайности. При инъекции исследователь не может контролировать, как именно внедренные фрагменты ДНК встроятся в геном будущего организма. Высока вероятность таких комбинаций, которые приведут к гибели животного еще на эмбриональной стадии. Тем не менее метод работает и вполне годен для ряда научных целей.
Развитие трансгенных технологий позволяет производить животные белки, востребованные фармацевтической промышленностью. Эти белки экстрагируются из молока трансгенных коз и коров. Также есть технологии получения специфических белков из куриного яйца.
Ножницы для ДНК
Но есть более эффективный способ на основе целевого редактирования генома по технологии CRISPR/Cas9. «Сегодня молекулярная биология в чем-то подобна эпохе дальних морских экспедиций под парусами, — говорит Вадим Жерновков. — Практически каждый год в этой науке происходят значительные открытия, которые могут изменить нашу жизнь. Например, несколько лет назад микробиологи обнаружили у давно, казалось бы, изученного вида бактерий иммунитет к вирусным инфекциям. В результате дальнейших исследований выяснилось, что ДНК бактерий содержат в себе особые локусы (CRISPR), с которых синтезируются фрагменты РНК, умеющие комплементарно связываться с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов, например с ДНК или РНК вирусов. С такой РНК связывается белок Cas9, представляющий собой фермент-нуклеазу. РНК служит для Cas9 гидом, помечающим определенный участок ДНК, в котором нуклеаза совершает разрез. Примерно три-пять лет назад появились первые научные труды, в которых разрабатывалась технология CRISPR/Cas9 для редактирования генома».
Трансгенные мыши позволяют создавать живые модели тяжелых генетических заболеваний человека. Люди должны быть благодарны этим крохотным существам.
По сравнению со способом введения конструкции для случайного встраивания, новый метод позволяет подобрать элементы системы CRISPR/Cas9 таким образом, чтобы точно нацелить РНК-гиды на нужные участки генома и добиться целенаправленной делеции или вставки нужной последовательности ДНК. В этом методе тоже возможны ошибки (РНК-гид иногда соединяется не с тем участком, на который его нацеливают), однако при использовании CRISPR/Cas9 эффективность создания трансгенов составляет уже около 80%. «Этот метод имеет широкие перспективы, и не только для создания трансгенов, но и в других областях, в частности в генной терапии, — говорит Вадим Жерновков. — Однако технология находится только в начале пути, и представить себе, что в ближайшее время исправлять генный код людей будут с помощью CRISPR/Cas9, довольно сложно. Пока есть вероятность ошибки, есть и опасность, что человек лишится какой-то важной кодирующей части генома».
Молоко-лекарство
Российской компании «Марлин Биотех» удалось создать трансгенную мышь, в которой полностью воспроизведена мутация, приводящая к миодистрофии Дюшенна, и следующим этапом станут испытания технологий генной терапии. Вместе с тем создание моделей генетических заболеваний человека на основе лабораторных животных — не единственное возможное применение трансгенов. Так, в России и западных лабораториях ведутся работы в области биотехнологий, позволяющие получать важные для фарминдустрии лекарственные белки животного происхождения. В качестве продуцентов могут выступать коровы или козы, у которых можно изменять клеточный аппарат производства содержащихся в молоке белков. Из молока можно экстрагировать лекарственный белок, который получен не химическим способом, а с помощью природного механизма, что повысит эффективность лекарства. В настоящее время разработаны технологии получения таких лекарственных белков, как лактоферрин человека, проурокиназа, лизоцим, атрин, антитромбин и другие.
Согласно данным, представленным Всемирной организацией здравоохранения, около 6% детей рождаются с различными отклонениями развития, обусловленными генетически. Этот показатель учитывает и те патологии, которые проявляются не сразу, а по мере взросления малышей. В современном мире процент наследственных заболеваний с каждым годом увеличивается, что привлекает внимание и сильно беспокоит специалистов всего мира.
Учитывая роль генетических факторов, наследственные заболевания человека можно разделить на следующие три группы:
1. Заболевания, развитие которых обусловлено только наличием мутированного гена
Такие патологии передаются от поколения к поколению. К их числу можно отнести шестипалость, близорукость, мышечную дистрофию.
2. Заболевания с генетической предрасположенностью
Для их развития необходимо воздействие дополнительных внешних факторов. Например, определенный природный компонент в составе продукта может вызвать серьезную аллергическую реакцию, а черепно-мозговая травма привести к появлению эпилепсии.
3. Заболевания, вызываемые влиянием инфекционных агентов или травмами, но не имеющие установленной специалистами связи с генетическими мутациями
В данном случае наследственность все же играет определенную роль. Например, в некоторых семьях дети очень часто страдают простудой, а в других, даже при близком контакте с инфекционными больными, остаются здоровыми. Исследователи полагают, что наследственные особенности организма также обуславливают многообразие видов и форм протекания различных заболеваний.
Причины наследственных болезней
Основная причина любого наследственного заболевания — мутация, то есть стойкое изменение генотипа. Мутации наследственного материала человека различны, их делят на несколько типов:
— Генные мутации представляют собой структурные изменения участков ДНК — макромолекулы, обеспечивающей хранение, передачу и реализацию генетической программы развития человеческого организма. Такие изменения становятся опасными в случае, когда приводят к образованию белков с несвойственными им характеристиками. Как известно, белки являются основой всех тканей и органов тела человека. Многие генетические заболевания развиваются вследствие мутаций. Например, муковисцидоз, гипотериоз, гемофилия и другие.
— Геномные и хромосомные мутации — это качественные и количественные изменения хромосом — структурных элементов клеточных ядер, обеспечивающих передачу наследственной информации от поколения к поколению. Если преобразования происходят лишь в их строении, то нарушения основных функций организма и поведения человека могут оказаться не столь выраженными. Когда изменения касаются и количества хромосом, развиваются очень тяжелые заболевания.
— Мутации половых либо соматических (не участвующих в половом размножении) клеток . В первом случае плод уже на стадии оплодотворения приобретает генетически обусловленные отклонения развития, а во втором лишь некоторые участки тканей организма остаются здоровыми.
Специалисты выделяют целый ряд факторов, которые могут провоцировать мутации наследственного материала, а в дальнейшем — рождение ребенка с генетическими отклонениями. К их числу относятся следующие:
— Родственная связь между отцом и матерью будущего малыша
В этом случае риск того, что родители окажутся носителями генов с идентичными повреждениями, возрастает. Подобные обстоятельства исключат шансы малыша на приобретение здорового фенотипа.
— Возраст будущих родителей
С течением времени в половых клетках проявляется все большее количество генетических повреждений, хоть и весьма незначительных. В результате риск рождения ребенка с наследственной аномалией увеличивается.
— Принадлежность отца или матери к определенной этнической группе
Например, часто у представителей ашкеназских евреев встречается болезнь Гоше, а у средиземноморских народов и армян — болезнь Вильсона.
— Воздействие на организм одного из родителей облучением , сильнодействующим ядовитым веществом или лекарственным средством.
— Нездоровый образ жизни
Структура хромосом подвержена влиянию внешних факторов на протяжении всей жизни человека. Вредные привычки, плохое питание, серьезные стрессы и многие другие причины способны приводить к «поломкам» генов.
Если, планируя беременность, вы желаете исключить генетические заболевания будущего малыша, обязательно пройдите обследование. Сделав это как можно раньше, родители получают дополнительный шанс подарить своему ребенку хорошее здоровье.
Диагностика генетических нарушений
Современная медицина способна выявить наличие наследственного заболевания на стадии развития плода и с большой вероятностью предсказать возможные генетические нарушения в период планирования беременности. Выделяют несколько методов диагностики:
1. Биохимический анализ периферической крови
и иных биологических жидкостей в организме матери
Он позволяет выявить группу генетически обусловленных заболеваний, связанных с нарушениями обменных процессов.
2. Цитогенетический анализ
Данный метод основан на анализе внутренней структуры и взаимного расположения хромосом внутри клетки. Его более совершенным аналогом является молекулярно-цитогенетический анализ, позволяющий обнаруживать малейшие изменения в строении важнейших элементов клеточного ядра.
3. Синдромологический анализ
Предполагает выделение ряда признаков из всего многообразия, свойственных конкретному генетическому заболеванию. Это осуществляется методом тщательного осмотра пациента и посредством использования специальным компьютеризированных программ.
4. Ультразвуковое исследование плода
Обнаруживает некоторые хромосомные болезни.
5. Молекулярно-генетический анализ
Определяет даже самые незначительные изменения в структуре ДНК. Позволяет диагностировать моногенные заболевания и мутации.
Важно своевременно определить наличие или вероятность наследственных заболеваний у будущего малыша. Это позволит принять меры на ранних стадиях развития плода и заранее предусмотреть возможности для минимизации неблагоприятных последствий.
Методы лечения наследственных заболеваний
До недавнего времени генетические заболевания практически не лечились в силу того, что это считалось бесперспективным. Предполагалось их необратимое развитие и отсутствие положительного результата в ходе медикаментозного и хирургического вмешательства. Однако специалисты существенно продвинулись в поисках новых эффективных способов лечения наследственных патологий.
На сегодняшний день можно назвать три основных метода:
1. Симптоматический метод
Направлен на устранение болезненных симптомов и замедление прогресса заболевания. К данной методике можно отнести использование анальгетиков при болевых ощущениях, применение ноотропных препаратов при деменции и подобное.
2. Патогенетическая терапия
Предполагает устранение дефектов, вызванных мутированным геном. К примеру, если он не производит определенный белок, то данный компонент искусственно вводят в организм.
3. Этиологический метод
Основан на генной коррекции: выделении поврежденного участка ДНК, его клонировании и дальнейшем применении в лечебных целях.
Современная медицина успешно лечит десятки наследственных заболеваний, однако говорить о достижении абсолютных результатов пока нельзя. Специалисты рекомендуют своевременно проводить диагностику и в случае необходимости принимать меры для снижения возможных генетических нарушений вашего будущего ребенка.
Группы генетических заболеваний
Развитие этой перспективной области стало возможным после определения нуклеотидной последовательности генома человека.
Наследственность и среда оказываются этиологическими факторами (причина без которой болезнь никогда не разовьется), но доля их участия при каждой болезни своя, причем чем больше доля одного фактора, тем меньше другого. Все формы патологии с этой точки зрения можно разделить на четыре группы, между которыми нет резких границ:
Первую группу составляют собственно наследственные болезни, у которых этиологическую роль играет патологический ген. В эту группу входят моногенно обусловленные болезни (такие как, например, фенилкетонурия, гемофилия), а также хромосомные болезни.
К хромосомным болезням относят формы патологии, которые клинически выражаются множественными пороками развития, а в качестве генетической основы имеют отклонения от нормального содержания в клетках организма количества хромосомного материала.
Вторая группа - это тоже наследственные болезни, обусловленные патологической мутацией, однако для их проявления необходимо специфическое воздействие среды. В некоторых случаях такое "проявляющее" действие среды очень наглядно, и с исчезновением действия средового фактора клинические проявления становятся менее выраженными. Таковы проявления недостаточности гемоглобина HbS у его гетерозиготных носителей при пониженном парциальном давлении кислорода. В других случаях (например, при подагре) для проявления патологического гена необходимо длительное неблагоприятное воздействие среды (особенности питания).
Третью группу составляет подавляющее число распространенных болезней, особенно болезней зрелого и преклонного возраста (гипертоническая болезнь, язвенная болезнь желудка, большинство злокачественных образований и другие). Основным этиологическим фактором в их возникновении служит неблагоприятное воздействие среды, однако, реализация действия фактора зависит от индивидуальной генетической предрасположенности организма. Необходимо отметить, что разные болезни с наследственным предрасположением неодинаковы по относительной роли наследственности и среды. Среди них можно было бы выделить болезни со слабой, умеренной и высокой степенью наследственного предрасположения.
Четвертая группа болезней - это сравнительно немногие формы патологии, в возникновении которых исключительную роль играет фактор среды. Обычно это экстремальный средовой фактор, по отношению к действию которого организм не имеет средств защиты (травмы, особо опасные инфекции). Генетические факторы в этом случае играют роль в течении болезни, влияют на ее исход.
Диагностика генетических заболеваний
Генная терапия включает следующие этапы:
1) получение клеток от больного (в генной терапии разрешено использовать только соматические клетки человека);
2) введение в клетки лечебного гена для исправления генетического дефекта;
3) отбор и размножение "исправленных" клеток;
4) введение "исправленных" клеток в организм пациента.
Впервые успешно применить генную терапию удалось в 1990 г. Четырехлетней девочке, страдающей тяжелым иммунодефицитом (дефект фермента аденозиндезаминазы), были введены собственные лимфоциты со встроенным нормальным геном аденозиндезаминазы. Лечебный эффект сохранялся в течение нескольких месяцев, после чего процедуру пришлось регулярно повторять, поскольку исправленные клетки, как и другие клетки организма, имеют ограниченный срок жизни. В настоящее время генную терапию используют для лечения более десятка наследственных заболеваний, в том числе гемофилии, талассемии, муковисцидоза.
Трудности диагностики обусловлены прежде всего тем, что формы наследственных болезней очень многообразны (около 2000) и каждая из них характеризуется большим разнообразием клинической картины. Некоторые формы встречаются крайне редко, и врач в своей практике может не встретиться с ними. Поэтому он должен знать основные принципы, которые помогут ему заподозрить нечасто встречающиеся наследственные заболевания, а после дополнительных консультаций и обследований поставить точный диагноз.
Диагностика наследственных болезней основывается на данных клинического, параклинического и специального генетического обследования.
В тех случаях, когда диагноз больному не поставлен и необходимо уточнить его, особенно при подозрении на наследственную патологию, используют следующие специальные методы:
1) подробное клинико-генеалогическое обследование проводится во всех случаях, когда при первичном клиническом осмотре возникает подозрение на наследственное заболевание. Здесь следует подчеркнуть, что речь идет о подробном обследовании членов семьи. Это обследование заканчивается генетическим анализом его результатов;
2) цитогенетическое исследование может проводиться у родителей, иногда у других родственников и плода. Хромосомный набор изучается при подозрении на хромосомную болезнь для уточнения диагноза. Большую роль цитогенетического анализа составляет пренатальная диагностика.
3) биохимические методы широко применяются в тех случаях, когда имеется подозрение на наследственные болезни обмена веществ, на те формы наследственных болезней, при которых точно установлены дефект первичного генного продукта или патогенетическое звено развития заболевания.
4) иммуногенетические методы применяют для обследования пациентов и их родственников при подозрении на иммунодефецитные заболевания, при подозрении на антигенную несовместимость матери и плода, при установлении истинного родительства в случаях медико-генетического консультирования или для определения наследственного предрасположения к болезням.
5) цитологические методы применяются для диагностики пока еще небольшой группы наследственных болезней, хотя возможности их достаточно велики. Клетки от больных можно исследовать непосредственно или после культивирования цитохимическими, радиоавтографическими и другими методами.
6) метод сцепления генов применяется в тех случаях, когда в родословной имеется случай заболевания и надо решить вопрос, унаследовал ли пациент мутантный ген. Это необходимо знать в случаях стертой картины заболевания или позднего его проявления.
В настоящее время проводится массовый скрининг новорожденных в роддомах для выявления некоторых наследственных заболеваний. Данные исследования позволяют поставить диагноз в ранние сроки и своевременно назначить эффективное лечение.
Больших успехов в последнее десятилетие достигла пренатальная диагностика наследственных заболеваний и врожденных пороков развития. Широкое распространение в медицинской практике получили следующие методы: ультразвуковое исследование, амниоцентез, биопсия хориона, кордоцентез, определение альфа-фетопротеина и хориогонина, ДНК- диагностика.
Огромный вклад в диагностику хромосомных болезней внесли генетики, внедрив в практику медицины метод дифференциальной окраски хромосом. С помощью этого метода можно определить количественные и структурные перестройки хромосом.
Большое теоретическое и практическое значение имеет изучение групп сцепления у человека и построение карт хромосом. В настоящее время у человека относительно изучены все 24 группы сцепления.
Наиболее распространенным и эффективным методом профилактики наследственных болезней и врожденных пороков развития является медико-генетическое консультирование, направленное на предупреждение появления в семье больных детей. Врач-генетик рассчитывает риск рождения ребенка с тяжелой наследственной патологией и при высоком риске, при отсутствии методов пренатальной диагностики дальнейшее деторождение в данной семье не рекомендуется.
С целью предупреждения рождения детей с наследственно детерминированными болезнями необходимо объяснять вред близкородственных браков молодым людям, планирующим создание семьи.
Беременным женщинам в возрасте старше 35 лет необходимо обследование у врача-генетика для исключения у плода хромосомной патологии.
Таким образом, применение достижений генетики в практической медицине способствует предупреждению рождения детей с наследственными заболеваниями и врожденными пороками развития, ранней диагностике и лечению больных.
Принято считать специфический генетический риск до 5% низким, до 10% - повышенным в легкой степени, до 20% - средним и выше 20% - высоким. Можно пренебречь риском, не выходящим за пределы повышенного в легкой степени, и не считать его противопоказанием к дальнейшему деторождению. Лишь генетический риск средней степени расценивается как противопоказание к зачатию или как показание к прерыванию уже имеющейся беременности, если семья не хочет подвергаться риску.
Лечение генетических заболеваний
Длительное время диагноз наследственной болезни оставался как приговор обреченности больному и его семье. Несмотря на успешную расшифровку формальной генетики многих наследственных заболеваний, лечение их оставалось лишь симптоматическим.
Симптоматическое лечение применяют при всех наследственных болезнях. Для многих форм патологии симптоматическое лечение является единственным.
Однако следует понимать, что ни один из существующих ныне методов не устраняет причину заболевания, так как не восстанавливает структуру поврежденных генов. Действие каждого из них продолжается сравнительно короткое время, поэтому лечение должно быть непрерывным. Кроме того, приходиться признать ограниченность возможностей современной медицины: еще многие наследственные болезни не поддаются эффективному подавлению. Особые надежды в связи с этим возлагают на использование методов генной инженерии для введения нормальных, неизмененных генов в клетки больного человека. Таким путем можно будет добиться кардинального излечения данного больного, но, однако это дело будущего.
Этиологическое лечение любых наследственных болезней является наиболее оптимальным, поскольку оно устраняет первопричину заболевания и полностью излечивает его. Однако устранение причины наследственного заболевания означает такое серьезное "маневрирование" с генетической информацией в живом организме человека, как "включение" нормального гена (или подсадку его), "выключение" мутантного гена, обратная мутация патологического аллеля. Эти задачи достаточно трудны даже для манипулирования с прокариотами. К тому же, чтобы провести этиологическое лечение какого-либо наследственного заболевания, надо изменить структуру ДНК не в одной клетке, а во всех функционирующих клетках (и только функционирующих). Прежде всего, для этого нужно знать, какое изменение в ДНК произошло при мутации, то есть наследственная болезнь должна быть записана в химических формулах. Сложности этой задачи очевидны, хотя методы для их решения уже имеются в настоящее время.
Принципиальная схема для этиологического лечения наследственных заболеваний как бы составлена. Например, при наследственных болезнях, сопровождающихся отсутствием активности фермента (альбинизм, фенилкетонурия), необходимо синтезировать данный ген и ввести его в клетки функционирующего органа. Выбор способов синтеза гена и его доставки в соответствующие клетки широкий, и они будут пополняться с прогрессом медицины и биологии. Вместе с тем необходимо отметить важность соблюдения большой осторожности при применении методов генетической инженерии для лечения наследственных болезней, даже если будут сделаны решительные прорывы в синтезе соответствующих генов и способах их доставки в клетки-мишени. Генетика человека еще не располагает достаточными сведениями обо всех особенностях функционирования генетического аппарата человека. Пока еще неизвестно, как он будет работать после введения дополнительной генетической информации.
Установление локализации и последовательности гена, мутации которого вызывают конкретные заболевания, а также самой мутации и современные способы ее тестирования позволяют диагностировать заболевание в нео- и даже пренатальный период развития организма. Это дает возможность смягчить проявление генетического дефекта с помощью медикаментозного лечения, диеты, переливания крови и т.д.
Однако такой подход не приводит к исправлению самого дефекта и, как правило, наследственные заболевания не излечиваются. Ситуация осложняется еще и тем, что мутация одного гена может давать самые разные последствия на организм. Если мутация гена вызывает изменения активности фермента, который он кодирует, то это может привести к накоплению токсичного субстрата или, наоборот, к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки.
Хорошо известным примером такого заболевания является фенилкетонурия. Его вызывает мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, катализирующего превращение фенилаланина в тирозин. В результате повышается уровень эндогенного фенилаланина в крови, что вызывает неправильное формирование миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток центральной нервной системы и, как следствие, тяжелую умственную отсталость.
Если мутация затрагивает ген структурного белка, то это может приводить к серьезным нарушениям на уровне клеток, тканей или органов. Примером такого заболевания является кистозный фиброз.
Делеция в гене, кодирующем белок, который называется транспортер кистозного фиброза, приводит к синтезу дефектного белка (отсутствие фенилаланина 508) и нарушениям транспорта ионов хлора сквозь клеточные мембраны. Одним из наиболее вредных последствий этого является то, что слизь, которая выстилает и защищает легкие, становится ненормально густой. Это затрудняет доступ к клеткам легких и способствует накоплению вредных микроорганизмов. Клетки, выстилающие воздухоносные пути легких, погибают и заменяются фиброзной рубцовой тканью (отсюда название болезни). В результате пациент погибает от нарушения дыхания.
Наследственные заболевания отличаются сложными клиническими проявлениями, и их традицинное лечение имеет в основном симптоматический характер: для лечения фенилкетонурии назначают безаланиновую диету, дефектные белки заменяют функциональным внутривенным введением, для компенсации утраченных функций проводят трансплантацию костного мозга или других органов. Все эти меры, как правило, малоэффективны, дороги, длительны, и лишь немногие пациенты доживают до старости. Поэтому разработка принципиально новых видов терапии очень актуальна.
Генная терапия
Генной терапией называется генетическая инженерия соматических клеток человека, направленная на исправление генетического дефекта, вызывающего заболевание. Коррекция специфического заболевания осуществляется путем введения в дефектные соматические клетки нормальных экспрессирующихся генов. К 80-м гг., когда были разработаны методы получения отдельных генов и созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали рутинными эксперименты по переносу генов на мышах, перспективы генной коррекции стали реальными.В 1990 г. в США доктором У. Френч Андерсоном (W. French Andrson) были предпринята первая попытка генотерапии для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) у трехлетней девочки Ашанти де Силва (Ashanthi da Silva). Это заболевание вызывается мутацией в гене, кодирующем аденозанаденилазу (АДА). Дефицит этого фермента способствует накоплению в крови аденозина и дезоксиаденозина, токсическое действие которых приводит к гибели В- и Т-лимфоцитов периферической крови и, как следствие, иммунодефициту.
Дети с таким заболеванием должны быть защищены от любых инфекций (содержаться в специальных стерильных камерах), поскольку любая болезнь может оказаться смертельной. Через 4 года после начала лечения у ребенка наблюдалась экспрессия нормально функционирующей АДА и облегчение симптомов ТКИД, что позволило ей покинуть стерильную камеру и жить нормальной жизнью.
Таким образом, была продемонстрирована принципиальная возможность успешной генетической терапии соматических клеток. Начиная с 90-х гг. проходят испытания генной терапии целого ряда генетических заболеваний, среди которых такие тяжелейшие, как гемофилия, СПИД, разные виды злокачественных новообразований, муковисцидоз и др. На данный момент поддаются излечению с помощью трансгенеза уже около 10 болезней человека.
Разнообразие генетических заболеваний предопределило развитие множества подходов генной терапии. При этом решаются 2 главные проблемы: средство доставки терапевтического гена; способ обеспечения адресной доставки к клеткам, предназначенным для коррекции. К настоящему времени все подходы к генной терапии соматических клеток можно разделить на две категории: терапия ex vivo и in vivo (рис. 3.15).
Рис. 3.15. Схема проведения генной терапии ex vivo (а) и in vivo (а)
Генная терапия ex vivo предполагает генетическое исправление дефектных клеток вне организма с последующим возвращением нормально функционирующих клеток в организм.
Генная терапия in vivo предусматривает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Рассмотрим эти подходы подробнее.
Генная терапия ex vivo включает следующие этапы:
1) получение дефектных клеток больного и их культивирование;
2) перенос нужного гена в изолированные клетки с помощью трансфекции терапевтической генной конструкции;
3) отбор и наращивание генетически исправленных клеток;
4) трансплантация или трансфузия этих клеток пациенту.
Использование собственных клеток пациента гарантирует, что после их возвращения у него не разовьется иммунный ответ. Процедура переноса генной конструкции должна быть эффективной, а нормальный ген должен стабильно поддерживаться и непрерывно экспрессироваться.
Средством переноса генов, созданного самой природой, являются вирусы. С целью получения эффективных векторов для доставки генов в основном используют две группы вирусов - аденовирусы и ретровирусы (рис. 3.16). В генной терапии применяют варианты генетически обезвреженных вирусов.
Рис. 3.16. Вирусы, применяемые для создания терапевтических векторов
Рассмотрим устройство и использование конструкций на основе ретро-вирусов. Напомним, что геном ретровируса представлен двумя идентичными одноцепочечными молекулами РНК, каждая из которых состоит из шести участков: два длинных концевых повтора (LTR) на 5" и 3" концах, некодирующая последовательность *Р+, необходимая для упаковки РНК в вирусную частицу, и три участка, кодирующих структурный белок внутреннего капсида (gag), обратную транскриптазу (pol) и белок оболочки (env) (рис. 3.17, а).
Рис. 3.17. Генетическая карта типичного ретровируса (а) и карта ретровирусного вектора (а)
Напомним, что жизненный цикл ретровируса включает следующие стадии:
1. Инфицирование клеток-мишени.
2. Синтез ДНК копии генома с помощью собственной обратной транскриптазы.
3. Транспорт вирусной ДНК в ядро.
4. Встраивание вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина.
5. Транскрипция мРНК с вирусной ДНК под контролем сильного промотора, локализованного на участке 5"-LTR.
6. Трансляция белков Gag, Pol и Env.
7. Образование вирусного капсида и упаковки двух РНК-цепей и молекул обратной транскриптазы.
8. Высвобождение вирионов из клетки.
При получении ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретро-вируса встраивают в плазмиду, удаляют большую часть гена gag и полностью гены pol и env, а вместо них встраивают «терапевтический» ген Т и при необходимости маркерный селективный ген Rg с собственным промотором (рис. 3.17, б). Транскрипция гена Т будет контролироваться все тем же сильным промотором, локализованным на 5"-LTR участке. На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы и максимальный размер ДНК-вставки примерно 8 тыс. п.о.
Полученную таким образом конструкцию можно саму по себе использовать для трансформации, но ее эффективность и последующая интеграция в геном клетки-хозяина крайне низки. Поэтому была разработана методика упаковки полноразмерной РНК ретровирусного вектора в интактные вирусные частицы, которые с высокой частотой проникают в клетку и гарантированно встраиваются в геном хозяина. Для этого была создана так называемая «пакующая» клеточная линия. В двух разных участках хромосом этих клеток вшиты ретровирусные гены gag и pol-env, лишенные способности паковаться из-за отсутствия последовательности + (84*+) (рис. 3.18).
Рис. 3.18. Схема получения упакованного вирусного вектора
То есть оба эти фрагмента транскрибируются, но при этом образуются лишенные РНК пустые капсиды. При трансфекции РНК вирусного вектора в такие клетки она встраивается в хромосомную ДНК и транскрибируется с образованием полноразмерной РНК ретровируса, и в таких условиях в капсидах упаковывается только РНК вектора (только в ней имеется +-последовательность). Образующиеся интактные вирусные частицы используют для эффективной доставки ретровирусного вектора в клетки-мишени.
Ретровирусы активно инфицируют только интенсивно делящиеся клетки. Для переноса генов их обрабатывают очищенными частицами упакованного ретровирусного вектора или совместно культивируют с производящей их клеточной линией, а затем осуществляют селекцию для разделения клеток-мишеней и пакующих клеток.
Трансдуцированные клетки тщательно проверяют на уровень синтеза продукта терапевтического гена, отсутствие компетентных по репликации ретровирусов, отсутствие изменений способности клеток к росту или функционированию.
Наиболее пригодными для проведения генной терапии являются клетки костного мозга. Это связано с наличием в нем тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые могут пролиферировать и дифференцироваться в различные типы клеток -В- и Т-лимфоциты, макрофаги, эритроциты, тромбоциты и остеокласты. Именно эти клетки применяют для лечения целого ряда наследственных заболеваний, среди них уже упомянутый нами тяжелый комбинированный иммунодефицит, болезнь Гоше, серповидноклеточная анемия, талассемия, остеопороз и др.
Помимо тотипотентных стволовых клеток костного мозга, которые трудно выделять и культивировать, используют стволовые клетки из пупoвинной крови (предпочтительное использование для генотерапии новорожденных), а также клетки печени - гепатоциты - для лечения гиперхолестеролемии.
При генной терапии in vivo особенно важно обеспечить доставку терапевтического гена к дефектным клеткам. Такую адресную доставку могут обеспечить модифицированные векторы, созданные на основе вирусов, способных инфицировать специфические виды клеток. Рассмотрим подход, разработанный для лечения уже упомянутого выше кистозного фиброза. Поскольку легкие являются открытой полостью, терапевтические гены к ним доставить относительно легко. Клонированный вариант здорового гена был введен в инактивированный аденовирус (рис. 3.19). Специфика этого типа вируса заключается в том, что он инфицирует выстилку легких, вызывая простуду.
Рис. 3.19. Схема получения вектора на основе аденовируса
Сконструированный таким образом вирус испытывали, распыляя его в нос и легкие экспериментальных животных, а затем людей-пациентов. В некоторых случаях наблюдалось введение и экспрессия здорового гена, и восстановление нормального переноса ионов хлора. Возможно, этот подход (введение нормального гена с помощью носовых аэрозолей) в ближайшем будущем будет широко использоваться для лечения симптомов кистозного фиброза в легких.
Кроме ретро- и аденовирусов в экспериментах по генной терапии используют и другие типы вирусов, например вирус Herpes simplex. Особенностью этого двунитевого (152 тыс. п.о.) ДНК-вируса является его способность специфически поражать нейроны. Известно множество генетических заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему - опухоли, метаболические нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона).
Вирус простого герпеса I типа (HSV) является весьма подходящим вектором для терапии таких заболеваний. Капсид этого вируса сливается с мембраной нейрона, и его ДНК транспортируется в ядро. Предложено несколько способов переноса терапевтического гена с помощью HSV-векторов и проведены успешные испытания на экспериментальных животных.
Вирусные векторы имеют несколько недостатков: высокая стоимость, ограниченная клонирующая емкость и возможная воспалительная реакция. Так, в 1999 г. в результате развившегося необычайно сильного иммунного ответа на введение аденовирусного вектора погиб 18-летний доброволец, принимавший участие в испытаниях препарата. В 2002 г. у двух детей во Франции во время лечения от иммунодефицита (введением терапевтических генов в стволовые клетки с помощью ретровирусов) развилось состояние, похожее на лейкемию.
Поэтому разрабатываются невирусные системы доставки генов. Самый простой и неэффективный способ - это инъекция плазмидной ДНК в ткани. Второй подход - это бомбардировка тканей микрочастицами золота (1-3 мкм), конъюгированными с ДНК. При этом терапевтические гены экспрессируются в тканях-мишенях и их продукты - терапевтические белки - поступают в кровь. Основным недостатком этого подхода является преждевременная инактивация или разрушение этих белков компонентами крови.
Доставку ДНК можно осуществить, упаковав ее в искусственную липидную оболочку. Полученные таким образом сферические частицы-липосомы легко проникают через клеточную мембрану. Созданы липосомы с самыми разными свойствами, однако пока эффективность такой доставки невысока, поскольку большая часть ДНК подвергается лизосомному разрушению. Также для доставки генетической конструкции синтезируют конъюгаты ДНК с различными молекулами, способными обеспечить ее сохранность, адресную доставку и проникновение в клетку.
В последние годы проводятся интенсивные эксперименты по созданию искусственной 47-й хромосомы, которая позволила бы включить большое количество генетического материала с полным набором регуляторных элементов для одного или нескольких терапевтических генов. Это дало бы возможность использовать геномный вариант терапевтического гена и тем самым обеспечить его стабильность и эффективную длительную экспрессию. Проведенные эксперименты показали, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей терапевтические гены, вполне реально, однако пока непонятно, каким образом вводить такую огромную молекулу в ядро клетки-мишени.
Основными проблемами, которые стоят перед генной терапией, помимо риска тяжелой иммунной реакции, являются трудности длительного хранения и функционирования терапевтической ДНК в организме пациента, мультигенность многих болезней, делающая их трудной мишенью для генной терапии, а также риск использования вирусов в качестве векторов.
Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ , лечение болезней путем введения пациенту здоровых ГЕНОВ вместо недостающих или поврежденных. Первый раз человека подвергли такому лечению в США в 1990 г. Это был четырехлетний ребенок, страдающий дефицитом редкого энзима, отсутствие которого разрушает иммунную систему человека. Исправление или замещение поврежденных генов производится по методам ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ. Здоровый ген вводят в какой-нибудь вирус (обычно переносчик легко поддающейся лечению инфекции) так, чтобы он был непосредственно нацелен на поврежденные клетки. С самого начала генная терапия была задумана как средство лечения наследственных заболеваний - муковисцидиоз или серповидная анемия, но также исследовались возможности применения метода для лечения других болезней, таких как рак, при которой ген поражается только спустя некоторое время. Хотя тысячи больных уже были излечены, главным образом в США, генная терапия еще не сказала своего слова. Не все из вводимых генов достигают цели, и не все, попавшие в поврежденную клетку, эффективно срабатывают. Существует также проблема использования вируса в качестве переносчика гена. Организм встречает вирус как «чужака», и у некоторых пациентов из-за этого наблюдается тяжелая иммунная реакция. Существует и теоретический риск того, что сам вирус может распространиться и вызвать рак.
Генная терапия используется для лечения тяжелых состояний иммунодефицита, когда исчезает ген, ответственный за выработку энзима адено-зина дезаминазы (АДА). Так как АДА очень важен для выработки лейкоцитов(белых кровяных телец), это приводит к тому, что организм становится беззащитен против инфекций. Тогда два ретро-вируса (1) вводятся в костный мозг, который может выработать РНК из своего ДНК (2), используя резервный энзим транскриптазы (3). Потом эта ДНК объединяется с человеческими хромосомами (4). Когда количество хромосом увеличивается, вырабатывается новая вирусная РНК, ви русные протеины и АДА (5). Вирусная РНК и вирусные белки вырабатывают много новых вирусов, а АДА используется организмом для производства жизненно важных лейкоцитов. Потом процесс повторяется и распространяется на весь костный мозг.
Научно-технический энциклопедический словарь .
Смотреть что такое "ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ" в других словарях:
генная терапия - Введение гена в организм для придания клеткам организма новых свойств Тематики биотехнологии EN gene therapy …
Термин генная терапия Термин на английском gene therapy Синонимы Аббревиатуры Связанные термины доставка генов, биологические нанообъекты, генная инженерия, геном, ДНК, капсид, РНК, многофункциональные наночастицы в медицине, олигонуклеотид,… …
Генная терапия - (gene therapy). Подход, занимающийся лечением генетических заболеваний, которое можно осуществлять в любой момент, от изменения структуры ДНК до изменения процесса синтеза протеинов … Психология развития. Словарь по книге
Генная терапия (генотерапия) - совокупность генно инженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний;... Источник: Федеральный закон от 05.07.1996 N 86 ФЗ… … Официальная терминология
генная терапия половых клеток - Генетические манипуляции с половыми клетками для придания организму новых свойств Тематики биотехнологии EN germ cell gene therapy … Справочник технического переводчика
генная терапия соматических клеток - Технология внедрения новых генов в соматические ткани, использующаяся в терапевтических целях Тематики биотехнологии EN somatic cell gene therapy … Справочник технического переводчика
генная избыточность - * генны лішак * genetic redundancy наличие большого количества копий к. л. структурного гена на хромосоме, обычно в составе мультигенного семейства. Генная инженерия * генная інжынерыя * gene enginеering раздел генетической инженерии (см.), для… … Генетика. Энциклопедический словарь
Комплекс средств и методов коррекции и предотвращения наследственных заболеваний. Включает методы метаболомики, генотерапии, диетотерапии и др. Содержание 1 Симптоматическое лечение 2 Генная терапия … Википедия
Термин генная инженерия Термин на английском genetic engineering Синонимы генетическая инженерия Аббревиатуры Связанные термины доставка генов, биоинженерия, биологические моторы, геном, ДНК, РНК, олигонуклеотид, плазмида, фермент, генная терапия … Энциклопедический словарь нанотехнологий
Или технология рекомбинантных ДНК, изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Биологи изолируют… … Энциклопедия Кольера
Книги
- Вы просто не умеете молодеть! Простые советы долгожителей. Тибетская йога "Долгой жизни" . Даосские системы омоложения. Кайя-кальпа "Вечное тело" . Рассаяна Аюрведы. Стволовые клетки против старости. Генная терапия. Худеть - значит молодеть! , Захаров Ю.. Главная особенность доктора Гаврилова, что он лечит не звезд, а нас с вами. Среди похудевших с помощью его методики уже несколько десятков тысяч (!) человек. Забудьтевсе, что вы знали до…
